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ayx中国官方网站·江西中医药大学:基于UPLC-Q-TOF-MS技术
发布时间:2024-03-01 11:30:58 来源:Ayx爱游戏官方在线登录 作者:ayx爱游戏体育网页版入口


  溃疡性结肠炎(ulcerative colitis ,UC )是一种肠道非特异性、慢性、复发性、炎症性疾病,主要特征为结肠黏膜上皮损伤和肠道内稳态破坏,表现为体质量减轻、腹痛、带血黏液腹泻、直肠萎缩,严重影响患者生活质量,UC 在我国患病率逐年增加 [1] 。目前常用的UC 治疗药物包括氨基水杨酸盐、和免疫 [2] ,然而,这些药物往往伴随着不良反应,且部分患者仍需要手术,因此,迫切需要开发安全有效的防治UC 的药物。

  白术具有健脾益气、燥湿利水的功效,用于脾虚食少、腹胀泄泻等有近数千年历史,其主治证候与 UC 一致,动物实验证明白术具有抗 UC 的作用 [3] 。白术作为一种重要的补益类中药,多糖是其重要活性成分,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖等组成 [4] 。UC 发病机制复杂,具有定性定量准确、覆盖面广、灵敏度高、高通量等优点的非靶向代谢组学检测技术为从整体上揭示药物作用机制提供了可能。故本研究在证实白术多糖具有抗UC 作用的基础上,进一步采用代谢组学技术探讨其对UC 的作用机制,为白术多糖用于UC 防治提供理论和实践基础。

  SPF 级雄性BALB/c 小鼠72 只,8 周龄,体质质量18 ~22 g ,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号SCXK (湘)2019-0004 。动物饲养于温度22 ~24 ℃、相对湿度50% ~60% 的屏障环境中,12 h 光照/ 黑暗交替,自由进食饮水,适应性饲养7 d 。动物实验经江西中医药大学动物实验科技中心伦理委员会批准(批准号JZLLSC20230350 )。

  白术饮片(批号04 )产地为安徽省鹿邑县郑集市,经江西中医药大学张寿文教授鉴定为菊科植物白术 Atractylodes macrocephala Koidz. 的干燥根茎。

  TripleTOF5600 型高分辨飞行时间质谱联用仪(美国AB SCIEX 公司);BAS124S 型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);Tecan Spark 多功能酶标仪(南昌树森实业有限公司);PLUS-E2-10TH 型实验室级超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司);真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);KQ5200B 型清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

  取白术饮片100 g ,粉碎,加10 倍量蒸馏水,回流提取3 次,每次2 h ,趁热滤过,合并滤液,减压浓缩至含生药0.2 g/mL ,乙醇醇沉,醇沉终体积分数为80% ,4 ℃静置24 h 后真空抽滤,依次用无水乙醇- 丙酮- 石油醚(60 ~90 ℃)- 无水乙醇洗涤沉淀,挥干有机试剂得淡白术粗多糖。白术粗多糖用 100 mL 蒸馏水溶解,并与 Sevage 试剂(氯仿 - 正丁醇4∶1 )按1∶3 混合搅拌25 min ,4000 r/min 离心10 min ,重复多次,直至无蛋白沉淀物。将上清液转移到透析袋(截留相对分子质量8000 ~14 000 )中,分别在自来水、双蒸水中各透析24 h ,透析过程中每隔2 h 换水。透析结束后进行冷冻干燥,最终得到白色粉末状白术多糖,采用相同的方法制备3 次,共得到白术多糖12.78 g 。

  2.2.1 葡萄糖标准曲线 ℃干燥至恒定质量的无水葡萄糖标准品10 mg ,蒸馏水溶解并定容至100 mL ,得到质量浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。精密量取无水葡萄糖标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 mL ,分别置于具塞试管中加水至2 mL ,各精密加入5% 苯酚溶液1 mL ,摇匀,迅速加入浓硫酸5 mL ,摇匀,放置10 min ,置40 ℃水浴保温15 min ,取出后冰水浴10 min ,放置室温作为样品。以水经过相同处理后为空白对照,用紫外- 可见分光光度计在490 nm 波长处测定吸光度( A )值,以葡葡萄糖含量为横坐标( x ),以 A 490 值为纵坐标( y ),绘制标准曲线 多糖含量的测定 精密称取干燥多糖样品5 mg ,蒸馏水定容至100 mL 量瓶中,采用苯酚- 硫酸法,移取白术多糖溶液0.8 mL ,按照“2.2.1 ”项下方法操作,用紫外- 分光光度计在490 nm 波长处测定,平行3 次,取平均值,测得 A 值,带入标准曲线的回归方程,计算总糖含量。

  BALB/c 小鼠适应性喂养7 d 后,随机分为对照组、模型组及白术多糖低、中、高剂量(60 、100 、200 mg/kg )组和美沙拉嗪(300 mg/kg )组,实验组每组 12 只。对照组每日饮用蒸馏水,其余组连续 12 d 自由饮用2.5% DSS 溶液。从造模第1 天起,各给药组ig 相应药物(20 mL/kg ),对照组和模型组ig 等体积蒸馏水,1 次/d ,连续12 d 。

  ,DAI)评分测定每日记录小鼠体质量、精神活动状态、毛发光泽、大便性状和便血情况,进行DAI 评分 [5] ,评分标准见表1 。

  末次给药后,小鼠禁食不禁水12 h ,摘眼球取血于抗凝管中,3500 r/min (离心半径10 cm )离心15 min ,取上清液, −80 ℃保存备用。按试剂盒说明书检测血清中TNF-α 、IL-10 水平及SOD 、MPO 活性。

  小鼠给予安乐死,迅速取出结肠,称定质量并记录结肠长度,经固定、脱水、包埋、切片、HE 染色后封片,于显微镜下观察并拍照。

  小鼠体质量变化率、DAI评分和结肠长度的影响实验期间,对照组小鼠状态良好;模型组小鼠毛色暗淡,出现懒动、血便、稀便等状况。经美沙拉嗪及白术多糖干预后,UC 小鼠上述状况均有所改善。如图1 所示,与对照组比较,模型组小鼠体质量显著降低( P <0.01 ),DAI 评分显著升高( P <0.01 ),结肠长度显著缩短( P <0.01 );与模型组比较,美沙拉嗪组小鼠体质量显著升高( P <0.01 ),DAI 评分显著降低( P <0.01 ),结肠长度显著增加( P <0.01 );白术多糖各剂量组小鼠体质量均显著升高( P <0.05 ),白术多糖中、高剂量组小鼠DAI 评分均显著降低( P <0.05 、0.01 ),结肠长度均显著增加( P <0.01 )。

  小鼠血清中炎症因子及氧化应激指标的影响如图2 所示,与对照组比较,模型组小鼠血清中MPO 活性和TNF-α 水平均显著升高( P <0.01 ),SOD 活性和IL-10 水平均显著降低( P <0.01 );与模型组比较,各给药组小鼠血清中MPO 活性和TNF-α 水平均显著降低( P <0.05 、0.01 ),SOD 活性和IL-10 水平均显著升高( P <0.05 、0.01 )。

  小鼠结肠组织病理变化的影响如图3 所示,模型组小鼠结肠黏膜可见溃疡,隐窝消失,杯状细胞溶解,并伴有大量炎性细胞浸润;白术多糖中剂量组黏膜充血,但杯状细胞结构较为完整;美沙拉嗪组及白术多糖高、低剂量组小鼠结肠黏膜未见溃疡及充血,炎性细胞浸润减少,炎症得到改善。

  小鼠血清代谢组学的影响3.5.1 血清代谢图谱 应用UPLC-Q-TOF/MS 进行血清样品的分离和数据采集,得到各组小鼠血清代谢图谱(图4 ),各组样品总离子流图基本相似,但各组峰形及峰面积存在一定差异,表明小鼠体内部分代谢物发生变化。

  3.5.2 代谢轮廓分析 采用PCA 分别对血清的代谢轮廓进行分析,结果见图5 。各组样本聚集在95% 的置信区间内,分为 3 类,其中对照组、美沙拉嗪组和白术多糖高、低剂量组为 1 类,模型组为 1 类,白术多糖中剂量组为一类,分离程度较高,说明 3 组代谢物组间差异较大。经 DSS 诱导后,模型组独自位于一侧,提示代谢物的种类或水平发生了显著变化;给予药物干预后,白术多糖高、低剂量组及美沙拉嗪组明显向对照组靠近。白术多糖中剂量组被分为另外一类,但和模型组还是存在明显的分类差别,说明白术多糖中剂量组也对 DSS 诱导的小鼠存在治疗作用,只是和白术多糖高、低剂量组表达程度不同,代谢轮廓结果与体质量变化率、炎症因子测定和病理切片的结果相呼应,说明给药无量效关系。

  3.5.3 OPLS-DA 在PCA 的基础上进行OPLS-DA ,模型组与各给药组完全分离,为防止模型出现过拟合,对模型进行200 次随机置换检验,血清样品的 Q 2 所在回归线与 Y 轴的截距均小于0 ,表明模型质量良好。S-plot 载荷图能够鉴定出导致组间差异的代谢物,图中的点距离原点越远,表明此化合物对分组的影响越大,Scatter 图综合了VIP 值,其离原点越远,表明此化合物为显著的差异代谢。


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