特发性肺纤维化（ idiopathic pulmonary fibrosis ， IPF ）是一种慢性、高死亡率的间质性肺病，由于成纤维细胞过度积聚，细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ）广泛沉积，最终导致肺泡结构受损，肺功能逐渐下降。 IPF 的预后较差，患者的生活质量受到严重的影响，并且由于继发性呼吸衰竭通常在诊断后 2 ～ 5 年内死亡 [1-2] 。吡非尼酮和尼达尼布在 2014 年被指南推荐用于 IPF 的临床治疗，但这 2 种药物的价格高昂，且无法彻底逆转纤维化 [3-4] 。因此探索经济并且可以有效延缓或治疗肺纤维化的药物尤为重要。

　　莪术油是莪术 Curcumae Rhizoma 的提取物，价格经济实惠，其主要成分包括莪术醇、莪术二酮、莪术酮、榄香烯等，具有抗肿瘤、抗菌、抗血栓形成等多种药理作用 [5-7] 。研究表明，莪术醇可下调肺纤维化大鼠肺组织中转化生长因子 -β1 （ transforming growth factor-β1 ， TGF-β1 ）和纤溶酶原激活剂 -1 的表达，缓解博来霉素引起的大鼠肺纤维化 [8] ，但其具体作用机制尚不明晰。铁死亡作为一种新的细胞死亡形式，与铁代谢紊乱、脂质过氧化积累、谷胱甘肽过氧化物酶 4 （ glutathione peroxidase 4 ， GPX4 ）、谷胱甘肽（ glutathione ， GSH ）缺乏有关，参与了纤维化的形成 [9-10] 。研究表明，泛素样含 PHD 和环指域 1 （ ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 ， Uhrf1 ）可通过调节 GPX4 和铁死亡抑制蛋白 1 （ ferroptosis suppressor protein 1 ， FSP1 ）的水平，从而促进肺纤维化；通过使用铁死亡，抑制铁的累积能够缓解由博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，提示铁死亡在肺纤维化的发生发展中可能扮演着重要的角色 [11-12] 。 本研究拟采用莪术油对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行干预治疗，以明确莪术油对肺纤维化的疗效，并通过检测 GPX4 、转铁蛋白受体 1 （ transferrin receptor 1 ， TFR1 ）、二价金属转运蛋白 1 （ divalent metal transporter 1 ， DMT1 ）等铁死亡关键蛋白，进一步阐述其作用机制。

　　40 只 SPF 级健康雄性 C57BL/6 小鼠，体质量 20 ～ 25 g ， 6 ～ 8 周龄，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SYXK （浙） 2021-0020 。动物饲养于温州医科大学实验动物中心，温度 20 ～ 25 ℃，相对湿度 40% ～ 70% ，人工昼夜明暗交替 12 h/ 12 h ，自由进食饮水。动物实验通过温州医科大学实验动物伦理审查会审查（批准号 wydw2022-0635 ）。

　　小鼠适应性喂养 1 周后，随机分为对照组（ 10 只）和造模组（ 30 只）。小鼠 ip 2% 戊巴比妥钠（ 45 mg/kg ），固定后灯光下寻找气管，插入留置针。 造模组小鼠通过气管插管注射博来霉素（ 3 mg/kg ） [13] ， 对照组注射生理盐水。造模完成后立即旋转小鼠，使博来霉素或生理盐水可以均匀分布肺中。待小鼠苏醒后，观察一般情况。根据课题组前期研究，以莪术油推荐每日最佳使用量换算作为低剂量，为了更好评估有效剂量的范围，以 4 倍临床剂量作为高剂量。将 30 只造模组小鼠随机分为模型组和莪术油低、高剂量（ 3.25 、 13.00 mg/kg ）组。造模 7 d 后开始给药，给药组连续 14 d 隔日 ip 莪术油，对照组和模型组 ip 等体积生理盐水，第 21 天处死小鼠。

　　末次给药 2 h 后，腹主动脉采血后处死小鼠，取血清用于 ELISA 检测。小鼠乙醇局部消毒，沿前中线剪开胸腔，暴露气管和心肺器官。用手术线结扎右肺，取右肺上叶保存，余下置于液氮中保存用于后续实验。分离气管后，用眼科剪在气管上端剪一“ Y ”形小口，插入留置针，左肺中打入 4% 多聚甲醛固定液，直至左肺饱满，结扎左肺剪下，固定后进行石蜡包埋。

　　每天记录小鼠体质量，给药结束后，取右肺上叶，称定质量后， 80 ℃烘箱中烘烤 72 h ，直至质量恒定，称定质量，计算肺干湿质量比，用于反映肺组织含水量。

　　取固定后的肺组织，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡后进行石蜡包埋，切片（厚度 4 μm ），脱蜡至水，进行 HE 和 Masson 染色，脱水，中性胶封片，于显微镜下观察肺组织病理变化。

　　取固定后的肺组织，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡后进行石蜡包埋，切片（厚 4 μm ），脱蜡至水，抗原修复后加入 0.2% 牛血清白蛋白，室温封闭 30 min ，滴加 collagen I （ 1 ∶ 500 ）、 GPX4 （ 1 ∶ 200 ）抗体， 4 ℃过夜孵育。室温复温 1 h 后，加入荧光二抗避光孵育 1 h 。 DAPI 复染 10 min 后，滴加防荧光淬灭剂封片。正置荧光显微镜下观察并拍照。 DAPI 紫外激发波长 330 ～ 380 nm ，发射波长 420 nm ，发蓝光； FITC 激发波长 465 ～ 495 nm ，发射波长 515 ～ 555 nm ，发绿光。

　　所有数据以 表示，以 Graphpad prism 9 统计软件进行分析处理，多组间比较采用单因素方差分析（ One-way ANOVA ），再通过 Tukey’s 检验来校正。

　　如图 1-A 所示，造模 7 d 后，对照组小鼠体质量增加，造模组小鼠体质量均下降；给药后，与模型组比较，莪术油低剂量组小鼠体质量显著增长（ P ＜ 0.05 ）。如图 1-B 所示，与对照组比较，模型组小鼠肺干湿质量比显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，莪术油低剂量组小鼠肺干湿质量比显著降低（ P ＜ 0.05 ）。

　　如图 2 所示， HE 染色结果表明，对照组小鼠肺组织结构清晰完整，肺泡和肺泡间隔正常，未见明显的病理性改变，未见胶原沉积。模型组小鼠的肺组织结构排列紊乱，肺泡壁显著增厚，肺泡不完整甚至不可见，肺泡腔内有大量的纤维组织团聚集，间质部分可见肌成纤维细胞增生，同时伴有炎性浸润。与模型组相比，莪术油组肺泡结构更加完整，炎性细胞浸润程度更轻，纤维化改变更少 。 Masson 染色结果表明，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中存在明显的间质内蓝色条索样胶原纤维沉积，伴随肺泡壁增厚和肺纹理紊乱。与模型组相比，莪术油组肺组织内的胶原沉积有一定程度减少。

　　如图 4 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中 IL-1β 、 IL-6 、 TNF-α 水平均显著升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与模型组比较，莪术油低剂量组小鼠血清中 IL-1β 、 IL-6 、 TNF-α 水平均显著降低（ P ＜ 0.01 ）。

　　如图 5 所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中 MDA 和 HYP 含量显著升高（ P ＜ 0.01 ）， GSH 含量显著降低（ P ＜ 0.01 ）， SOD 活性呈降低趋势；与模型组比较，莪术油各剂量组 GSH 含量显著升 高（ P ＜ 0.01 ）， MDA 含量显著降低（ P ＜ 0.01 ）， SOD 活性呈升高趋势；莪术油低剂量组 HYP 含量显著降低（ P ＜ 0.05 ）。

　　如图 6 所示，与对照组比较，模型组肺组织中 GPX4 蛋白表达水平显著降低（ P ＜ 0.01 ）， TFR1 和 DMT1 蛋白表达水平显著升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与模型组比较，莪术油各剂量组 GPX4 蛋白表达水平显著升高（ P ＜ 0.01 ）， TFR1 和 DMT1 蛋白表达水平显著降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。 免疫荧光染色结果与 Western blotting 结果一致，与对照组比较，模型组 GPX4 阳性 表达减少；与模型组比较，莪术油组 GPX4 阳性 表达增加。

　　肺纤维化是一种慢性间质性肺病，主要特征为 ECM 的过度表达和沉积、肌成纤维细胞形成的纤维灶累积以及肺重塑异常[14] 。上皮- 间充质转化（epithelial-mesenchymal transition ，EMT ）是间充质细胞产生和ECM 过度分泌的重要途径之一，最终可能导致肺纤维化的发生[15] 。EMT 的过程主要表现为上皮黏附蛋白下调和间质细胞标记物α-SMA 上调，同时包括纤连蛋白、vimentin 、collogen I 、collogen III 、collogen IV 等的生成[16] 。莪术为姜科姜黄属植物，其性温，味辛、苦，归肝、脾经，其功效为破血祛瘀行气、消肿止痛。莪术油是从莪术中提取的挥发油，临床常用于抗炎、抗肿瘤治疗[17] 。本课题组前期研究已证实莪术提取物对脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS ）引起的小鼠急性肺损伤有一定的改善作用[18]。

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