胃癌是一种起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位列全球恶性肿瘤的前5名，对人们的健康造成巨大威胁[1-2]。顺铂是一种能够产生有效细胞毒性的非特异性抗肿瘤药物，被广泛应用于胃癌的治疗。但其在治疗过程中的持续使用会逐渐产生耐药性[3-4]，因此寻求一种疗效确切且可以减少胃癌细胞顺铂耐药性的药物尤为重要。

　　肿瘤细胞的代谢重编程是肿瘤的重要特征，代谢重编程发生在肿瘤生成的各个阶段，与细胞对抗癌药物的敏感性也有很密切的关系。相较于糖代谢，对肿瘤细胞中脂质代谢的研究较少，但近年越来越多的研究证明在肿瘤细胞中，脂质代谢也发生了明显的变化 [5] 。脂质作为第二信使和激素在信号传递中扮演着重要的角色，脂质堆积在肿瘤中非常常见，它本身被视为癌症的标志 [6] ，脂肪酸的合成和氧化也受到过氧化物酶体增殖物激活受体（ peroxisome proliferators-activated receptors ， PPARs ）转录因子家族的调控 [7] 。肿瘤耐药的机制十分复杂，研究发现抑制 PPAR 对于治疗肿瘤耐药有显著的抑制作用， PPAR 介导的脂肪酸氧化水平升高会导致耐药的发生 [8] 。三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶（ adenosine triphosphate citrate lyase ， ACLY ）是糖酵解和脂质代谢的连接酶，是肿瘤细胞脂肪酸从头合成的第一步，在多种肿瘤中表达增加 [9] ，已有研究发现可通过下调 ACLY 抑制磷脂酰肌醇 3- 激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase ， PI3K ） / 蛋白激酶 B （ protein kinase B ， Akt ）通路和激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（ adenosine monophosphate-activated protein kinase ， AMPK ） / 活性氧（ reactive oxygen species ， ROS ）通路逆转卵巢癌顺铂耐药 [10] 。因此，抑制 PPAR 和 ACLY 可能是克服肿瘤顺铂耐药的新策略。通过调控脂代谢可以改善胃癌细胞耐药性，研究脂质代谢物的改变对于阐明脂质代谢在胃癌细胞耐药中的作用意义重大 [11] 。

　　中医治疗肿瘤类疾病依据扶正祛邪的原则，中药辅助放射治疗、化疗可增敏减毒，改善耐药，减少术后复发转移，提高患者生存质量 [12-13] 。因此，研究中医药改善肿瘤耐药的机制具有重大意义。陈皮是最常用的理气药，具有理气健脾、燥湿化痰的功效。药理学研究表明陈皮及其有效成分类黄酮可以减少肝脏中的脂质堆积 [14] 。川陈皮素是多甲氧基黄酮类化合物，是陈皮中发挥作用的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、降血糖、调血脂等多种药理活性 [15-17] ，川陈皮素作为一类天然的活性物质，具有较高安全性。已有研究发现川陈皮素能有效缓解由高脂膳食诱导的代谢紊乱，可改善血脂水平和肝脏脂肪变性程度 [18] ，但其对胃癌耐药的作用却鲜有报道。因此，本研究基于中药理论并结合网络药理学和脂质组学方法探究川陈皮素在胃癌顺铂耐药中的作用，并从分子层面揭示川陈皮素改善胃癌细胞顺铂耐药的机制。

　　人胃腺癌细胞株（ AGS ）和人胃腺癌顺铂耐药株（ AGS-DDP ）购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

　　将样本加入200 µL 4 ℃超纯水中，涡旋混匀，加入240 µL 预冷甲醇，涡旋混合后加入800 µL 甲基叔丁基醚 ，再次涡旋混合后低温水浴中超声20 min ，室温放置30 min ，10 ℃、14 000 × g 离心15 min ，取上层有机相，氮气吹干， −80 ℃保存样本。样品采用UHPLC Nexera LC-30A 超高效液相色谱系统进行分离，柱温45 ℃；体积流量300 μL/min ；流动相A 为10 mmol/L 甲酸铵乙腈水溶液（乙腈- 水6 ∶4 ），B 为10 mmol/L 甲酸铵乙腈异丙醇溶液（乙腈- 异丙醇1 ∶9 ），梯度洗脱：0 ～2 min ，30% B ；2 ～25 min ，30% ～100% B ；25 ～35 min ，100% ～30% B 。整个分析过程中样品置于10 ℃自动进样器中，为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。

　　采用LipidSearch 自动化脂质组学分析软件进行峰识别、峰提取、脂质鉴定等处理，主要参数：前体耐受性5 ×10 − 6 ，产物离子阈值5% 。对LipidSearch 提取得到的数据进行数据分析，包括单变量统计分析、多元变量统计分析、层次聚类分析和相关性分析等；单变量统计分析包括Student’s t-test/ 非参检验和变异倍数分析。

　　在脂质代谢组学分析得到的结果中，根据差异倍数（fold change ，FC ）值由高到低筛选出前20 个耐药细胞的代谢物，并将其导入MetaboAnalyst 5.0 进行系统通路分析 [19] 。以Impact ＞0.1 和 P ＜0.05 为筛选条件，确定最相关的路径，最后将分析出的代谢途径输入GSEA GENE Set Enrichment Analysis 网站获得该代谢途径的相关靶点信息。

　　在TCMSP 中预测的川陈皮素靶点进行KEGG 富集分析。使用Sangerbox 3.0 在线平台进行数据分析和可视化的KEGG 富集分析。最后将 P ＜0.01 设定为阈值，以确定具有显著差异的生物过程和信号通路。

　　TCMSP 数据库是根据中药系统药理学的相关理论建立的。药物筛选以吸收、分布、代谢、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion ，ADME ）为标准，如口服生物利用度、半衰期、药物亲和性、Caco-2 渗透性、血脑屏障和Lipinski 规则 [20] 。从TCMSP 数据库中检索川陈皮素中的靶点；以“glycerophospholipid metabolism ”为关键词，在GENE Card 数据库中检索磷脂代谢通路相关的靶点，得到的结果以“Relevance ”为指标获得相关靶点，将预测的靶点与川陈皮素的靶点联系起来，得到的交集基因上传到STRING 网站进行蛋白质- 蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI ）分析，根据PPI 的结果，建立了包含药物和代谢物相互作用的基因之间关系的网络图。

　　将处于对数生长期的AGS 和AGS-DDP 细胞细胞分别用胰酶消化，离心收集后重悬，然后以5000 个/ 孔接种于96 孔板中。分别用不同浓度（0 、1 、5 、10 、50 、100 μmol/L ）的顺铂或者不同浓度（0 、5 、10 、100 、150 、200 μmol/L ）的川陈皮素分别处理细胞24 、48 h ，或者50 μmol/L 的川陈皮素联合不同浓度（0 、1 、5 、10 、50 、100 μmol/L ）的顺铂处理24 h ，另设置不接种细胞不加入药物的空白孔，每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂继续培养1 h ，用全自动酶标仪测定450 nm 处的吸光度（ A ）值，计算细胞存活率。

　　AGS-DDP 细胞以2 ×10 3 个/ 孔接种于6 孔板中，用不同浓度（0 、50 、100 、200 μmol/L ）的川陈皮素处理24 h 后，更换完全培养基生长10 d ，然后用多聚甲醛固定细胞，再加入0.1% 结晶紫溶液染色10 min ，染色后拍照，最后进行细胞克隆计数。

　　取对数生长期AGS-DDP 细胞，以5 ×10 5 个/mL 接种于6 孔板中，2 mL/ 孔，置于37 ℃、5% CO 2 培养箱中培养24 h ，用200 μL 微量移液器的吸管垂直划3 条线，划痕完毕后，用移液器缓慢吸出培养液，用PBS 洗涤细胞2 次，除去细胞碎片。用不同浓度（0 、50 、100 、200 μmol/L ）的川陈皮素分别处理12 、24 、48 h ，将6 孔板置于倒置显微镜下观察拍照，使用Image J 软件进行数据统计及处理。

　　取对数生长期AGS-DDP 细胞，以2 ×10 5 个/ 孔接种于6 孔板中，用不同浓度（0 、50 、100 、200 μmol/L ）的川陈皮素处理24 h ，收集细胞，加入RIPA 裂解液于冰上裂解15 min 。4 ℃、12 000 × g 离心20 min ，吸取上清，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，加入5% 牛血清白蛋白溶液封闭1 h ，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温摇床孵育1 h 后，经TBST 漂洗，使用ECL 液进行发光，用Image J 软件进行条带分析。

　　采用GraphPad Prism 8.0 软件对实验结果进行统计分析及作图，两组间比较采用 t 检验分析，两组以上比较采用单因素方差分析。

　　主成分分析结果表明2 组细胞能够得到明显的区分，提示本实验建立的模型具有较高可靠性（图1-A ）；火山图展示AGS 和AGS-DDP 细胞中脂质分子的整体差异表达倍数情况，图中的点为FC ＞1.5 或FC ＜0.67 、 P ＜0.05 的脂质分子，即单变量统计分析筛选的差异脂质分子（图1-B ）；热图显示了AGS-DDP 和AGS 细胞差异脂质的层次聚类结果（图1-C ）；弦图显示了AGS 和AGS-DDP 细胞差异脂质的相关性分析结果（图1-D ）。

　　根据FC值筛选出了差异最为显著的前20个脂质代谢产物，热图显示了这20个代谢物（图2）。将这20个代谢产物导入MetaboAnalyst网站中，最终分析得到的5条代谢通路（磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚油酸代谢、糖基磷脂酰肌醇-锚生物合成、花生四烯酸代谢）。以Impact＞0.1、P＜0.05为指标来确定最相关的途径，重点分析了差异最为显著的磷脂代谢途径。

　　将川陈皮素的34 个靶点与从GENE Card 数据库获得磷脂代谢相关的548 个潜在靶点相交，其同作用的靶点有8 个，分别是PTGS1 、PPARγ 、F10 、PTGS2 、ESR2 、NCOA2 、CREB1 、 PLA2G4A 。将数据导入 Cytoscape 进行可视化后显示 2 个节点（红色倒三角表示川陈皮。

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