在我们的研究中，结合蛋白质组学和代谢组学策略与IPA生物信息学分析，我们筛选了代谢分析，蛋白质分析在CaOx晶体诱导的肾损伤小鼠中发生了显着变化，发现CaOx晶体可以通过Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK途径诱导炎症反应和氧化应激，并影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化， 导致肾损伤。

　　肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是慢性肾脏病（CKD）进展为终末期肾功能衰竭的重要过程。肾结石是最常见的肾脏疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，可增加肾纤维化的风险。草酸盐晶体诱导的肾损伤是肾结石的早期阶段;探索肾结石的防治机制具有重要意义。本研究采用草酸钙（CaOx）晶体诱导肾损伤的啮齿动物模型，采用蛋白质组学和代谢组学相结合的网络分析方法，揭示晶体肾损伤的机制，为肾结石的干预提供潜在靶点。采用基于UHPLC-Q/TOF-MS平台的代谢组学方法和iTRAQ定量蛋白质组学方法，从肾组织中筛选出与对照组相比，Crystal组有显著变化的肾组织244种代谢物和886种蛋白质。然后，应用独创性途径分析（IPA）通过关联和整合差异代谢物和蛋白质来构建蛋白质到代谢的调节网络。结果表明，CaOx晶体可通过Akt、ERK1/2和P38 MAPK通路诱导炎症反应和氧化应激，影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化，导致肾损伤，为肾结石的早期防治提供了重要方向。

　　肾结石是泌尿外科最常见的疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，增加慢性肾脏病（CKD）、肾纤维化、冠心病和中风（ 1-3 ）的风险。肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是CKD进展为终末期肾功能衰竭的重要过程（ 4 ）。肾结石和肾纤维化往往会持续多年，因此在肾功能严重受损甚至发生衰竭之前，很难识别疾病进展。而且，在现阶段，无论肾结石还是肾纤维化，其发病机制尚未明确。因此，迫切需要加强对肾结石和肾纤维化机制的研究。 近年来，随着高通量技术的飞速发展，蛋白质组学和代谢组学已被广泛用于研究肾脏疾病（ 的机制，如CKD，急性肾损伤和糖尿病肾病。蛋白质组学主要关注蛋白质，而代谢组学则侧重于下游小分子代谢物。蛋白质和代谢物是连接基因型和表型的重要中间分子。蛋白质组学和代谢组学的联合网络分析是探索基因表型潜在机制的有效工具（8 ）。Wettersten等人使用蛋白质组学和代谢组学技术广泛分析了人肾细胞癌组织，发现谷胱甘肽通路在肾细胞癌细胞中上调，β氧化途径受到抑制，这为开发肾癌的新型抗代谢治疗策略提供了坚实的理论基础（9 ）。

　　肾结石因其患病率高、复发率高而影响患者的生活质量，加重了人们的经济负担。目前，肾结石病的研究主要集中在结石形成的机理（ 10 ， 11 ），早期诊断技术（ 12 ， 13 ），治疗策略（ 14 ， 15 ）等。肾结石的发病机制复杂，至今尚无统一结论。本研究聚焦于蛋白质组学和代谢组学的综合分析策略，而不是单一蛋白质组学（ 16 ）或代谢组学（ 17 ），分析肾结石小鼠在多个方面的内部变化，从而克服单组学的局限性，旨在进一步揭示肾结石小鼠代谢调节网络的变化。

　　乙醛酸（50%在水中）是从TCI（日本东京）购买的。iTRAQ套件是从AB SCIEX（美国加利福尼亚州福斯特城113号）购买的。甲醇和乙腈是从默克（德国达姆施塔特）购买的。使用Milli-Q水净化系统制备超纯水（Millipore Corp.，Billerica，MA，USA）。甲酸，甲酸铵和2-氯-L-苯丙氨酸是从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得的。

　　所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物护理和使用指南》进行。从上海SLAC实验动物有限公司（中国上海）购买了约40只野生型雄性C57BL / 6小鼠（7-8周）。在有条件的住房1周后，将这些小鼠随机分为对照组和水晶组，每组20只小鼠。所有小鼠都可以免费获得食物和水。Crystal组小鼠以120mg / kg的剂量注射乙醛酸盐，每日一次，持续5天，对照组小鼠以相同体积的盐水注射。在动物实验结束时，从所有小鼠的眼球中抽取血液，然后在原位有氧灌注后收获所有肾脏。将每组3个肾组织固定在4%多聚甲醛中，进行进一步的组织学分析;其他的立即储存在-80°C。在4°C下保持相同2小时后，将血液以3，500rpm离心15分钟，然后在-80°C下收集血清。

　　处理固定组织以进行石蜡包埋，制备3-4μm切片并用Von Kossa染色。使用显微镜观察皮质和延髓交界处的肾钙沉积。使用迈瑞生化分析仪BS-380（中国广东）测定血清肌酐和尿素氮含量。采用比色法测定钙测定试剂盒测定新鲜肾组织中的钙含量，采用南京建城（中国江苏）商业试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Sod）和丙二醛（MDA）的活性。使用从南京建城（中国江苏）购买的ELISA试剂盒测定白细胞介素-6（Il-6），白细胞介素-10（Il-10），白细胞介素-1β（Il-1β），肿瘤坏死因子-α（Tnf-α），细胞间细胞粘附分子（Icam）和血管细胞粘附分子（Vcam）的水平。靶蛋白的免疫组织化学染色使用碧欧泰生物科技（中国江苏）的DAB检测试剂盒在肾脏切片上进行。所有一抗均来自Proteintech Group（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。

　　每组8个肾组织用于代谢组学分析。称取冷冻组织，然后用含有4μg/ ml 2-氯-L-苯丙氨酸的1.5ml 80%甲醇溶液匀浆2 min。然后，将匀浆物在4°C下以13，000rpm离心15分钟。将上清液转移到注射瓶中，并与10-μl等分试样上清液混合作为质量控制（QC）样品。 在安捷伦 1290 Infinity LC 系统上进行代谢组学分析，该系统配备安捷伦 6538 精确质量四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦）（UHPLC-Q/TOF-MS），使用沃特世 XBridge BEH 酰胺柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，马萨诸塞州米尔福德）和沃特世 XBridge BEH C18 色谱柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，米尔福德， MA， USA）。酰胺柱的流动相由含有0.1%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液（A相）和含有0.1%甲酸的乙腈溶液（B相）组成。洗脱条件为0~1 min，95%B;1–3 分钟， 95–85%B;3–13 分钟， 85–60%B;并且发布时间为5分钟以平衡系统。将流速设置为0.4ml / min;柱温设定为25°C;注射体积为4μl。C18色谱柱的流动相为0.1%甲酸（相A）和用0.1%甲酸（相B）修饰的乙腈。洗脱条件为0~2 min，2%B;2–10 分钟， 2–66%B;10–17 分钟， 66–98%B;17–19 分钟， 98%B;而且发布时间是5分钟。将流速设置为0.4ml / min;柱温设定为25°C;注射体积为2μl。质量数据是在ESI和ESI中获取的 + − 质量范围从 50 到 1，100 Da 的模式。毛细管电压在正模式下为4 kV，在负模式下为3.5 kV，气体温度为350°C，分段电压为120 V。MS/MS的碰撞能量范围为10至40 eV。 采用上述UHPLC-Q/TOF-MS方法对组织样品进行分析，并将QC样品均匀地插入序列中，以评估系统的稳定性。

　　大量数据的预处理基于我们之前报告的方法（ 18 ）。开源R软件包XCMS用于峰提取，对齐和集成。然后，使用SIMCA-P软件（版本11.0，Umetrics，Umea，瑞典）对这些变量进行分析，以进行多变量统计分析，以评估UHPLC-Q / TOF-MS系统的稳定性。代谢注释基于将从代谢组学分析和合并QC样品上的MS / MS谱图中获得的准确m / z值与Metlin数据库中条目的准确m/z值相匹配（ ）。根据MS / MS频谱图鉴定的代谢物被准确注释，并且仅基于m/z值（MS）鉴定的代谢物被推定注释。在代谢注释之后，使用安捷伦 MassHunter Profinder B.06.00 检查并量化了所有已识别的峰。在一种以上的液相色谱-质谱（LC-MS）方法中报告了一些代谢物，其中选择了QC样品的良好峰形和最小的方差系数。

　　基于我们之前的方案，将来自每组不同小鼠的9个冷冻肾组织用于iTRAQ定量蛋白质组学分析（19）。随机地，每组中的三个组织作为新样本合并在一起。从合并的样品中提取蛋白质，纯化，然后使用BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。使用iTRAQ缓冲液试剂盒中的还原试剂和半胱氨酸封闭试剂还原来自每个混合样品的约100μg蛋白质并烷基化，并使用测序级胰蛋白酶[1：50（w：w）]水解成肽。对照组的样本标记有113，115，117个标签，Crystal组的样本标记为114，116，118个标签。将标记的肽混合在一起，然后使用安捷伦ZORBAX 300Extend-C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）通过高pH反相液相色谱法（pH = 10）进行分馏。洗脱液被合并成10个馏分，在Eksigent nano LC-Ultra上进行分析。 断续器系统串联 TripleTOF 5600（AB SCIEX， CA， USA）。使用溶剂A（2%ACN与0.1%甲酸）以3μl /min的速率将约3μl样品加载到纳米LC捕集柱（ChromXP C18CL，3μm，3μm×0.5mm）中，以3μl/min的速率加载到纳米LC捕集柱（ChromXP C18CL，3μm，75μm×150mm）中使用溶剂A（2%ACN和0.1%甲酸溶液）和溶剂B（ACN溶液与2%水和0.1%甲酸），速率为300 nl / min，90分钟梯度洗脱为0-0.1分钟，5-10%B;0.1–60 分钟， 10–28%B;60–75 分钟， 28–50%B;75–75.5 分钟， 50–80%B;75.5–80 分钟， 80%B;80–80.5 分钟， 80–5%B;和80.5-90分钟，5%B。质量数据是在ESI模式下收集的，MS范围为350-1，250 Da，MS/ MS范围为100-1，500 Da。每个周期最多选择40个前体进行碎片化，使用滚动碰撞能量，动态排除18 s，碎片的电荷设置为+2至+5。++

　　使用独创性途径分析（IPA）软件分析定量的差异蛋白和代谢物（Qiagen，Redwood City，CA，USA）。将包含差异表达蛋白和代谢物的ID、折叠变化值和p值的数据集上传到IPA进行核心分析，其中可以进行与草酸钙（CaOx）晶体诱导的肾损伤相关的规范途径、疾病和功能、上游调节剂分析、毒性分析和网络分析。规范通路显示整个数据集中最重要的相关规范通路（代谢通路和信号通路）。疾病和功能分析检查数据集中已知影响疾病和功能的分子，将分子的变化方向与文献中得出的期望进行比较，然后根据变化方向对每种疾病和功能进行预测。IPA上游调节剂分析用于识别上游调节剂，并根据在数据集中观察到的分子变化，根据上游调节剂和目标之间的预期因果效应预测它们是否被激活或抑制。毒素清单是已知参与特定类型毒性的分子清单。IPA-Tox分析将毒性函数与毒性列表结合使用，将实验数据与临床病理学终点联系起来，了解药理学反应，并支持毒性假说产生的作用机制和机制。网络分析模块分析具有共同功能的分子之间的相互作用，以构建网络。整个核心分析依赖于Ingenuity®知识库，该知识库由IPA内容科学家根据文献手工策划。IPA评分主要基于p和z评分的值，p的值基于右尾费雪精确检验算法计算，反映实验中一组有意义的分子与已知过程/途径/转录之间的关联是否来自随机匹配。而z得分算法旨在降低随机数据生成重要预测的机会。如果分子/功能的z评分大于2，则通常认为其被显着激活，如果小于−2，则认为其被显着抑制。

　　Von Kossa染色在皮质和延髓交界处的肾组织显示晶体组（ 图1A、B 。

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