结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，也是单一传染病致死率最高的病原菌。据统计，2022 年，由于感染结核分枝杆菌引起的死亡人数达 160 万。过去 5 年，每年有将近 50 万结核病人发展出对一线抗结核药物利福平的耐药性，有将近 80%的病内的结核分枝杆菌携带多重耐药基因突变。仅仅依靠新型抗生素的研发不足以解决结核分支杆菌带来的巨大威胁。对于中低收入国家来说，高效的结核分枝杆菌疫苗仍然是阻止感染的有力手段。

　　当前，并没有用于预防结核分枝杆菌感染或者阻止激活活动性结核病的成年人结核菌疫苗，唯一批准使用的 BCG 卡介苗只能够在青少年中有效阻止结核菌感染。结核亚单位佐剂候选疫苗 M72/AS01E 包含 M72 重组融合蛋白（来自 Mtb32A 和 Mtb39A 抗原），使用 GSK 专利佐剂系统 AS01。AS01E 也是 GSK 带状疱疹疫苗中所使用的佐剂。M72/AS01E 疫苗能够在γ干扰素释放试验呈阳性的人群中阻止非活动性结核病发展为活动性结核病。得益于疫苗递送平台的革新和针对结核菌的免疫系统的深入了解，人们重新燃起对于结核疫苗的研发。

　　很久以来，人们一直将是否触发 CD4+ Th1 免疫反应作为结核菌候选疫苗免疫原性的基准。事实上，保护机体免于感染结核分枝杆菌和引发结核病的免疫系统是一个涉及许多免疫细胞类型的复杂过程，除了经典的 CD4+ Th1 免疫反应，CD8+ T 细胞反应也发挥着极其重要的作用，但是，在大多数结核疫苗的研发过程中，并未将触发 CD8+ T 细胞反应作为首选项。CD8+ T 细胞可迁移到结核菌感染部位，移除 MHCⅠ或者在体内使得结核菌变得更加敏感。溶原性的 CD8+ T 细胞还能够产生一种非常关键的炎症因子 IFNγ，有助于裂解结核菌感染的巨噬细胞。由于 CD8+ T 细胞能够归巢到肺部组织，因此，在临床前动物模型的攻毒试验中，CD8+ T 细胞还有助于减少细菌载量。近期在非人灵长类动物模型中的研究发现，相比于无法触发具有促炎症作用的 CD8+ T 细胞反应的皮层注射 BCG 疫苗路线，采用静脉注射 BCG 疫苗路线能够在结核菌攻毒试验中获得更好的免疫保护效果。总结来说，CD8+ T 细胞反应的免疫作用在结核疫苗的研发中被大大低估了。

　　2023 年 1 月 5 号，Rhea N. Coler 等人在 Vaccine 上面发表文章：An RNA-Based Vaccine Platform for Use against Mycobacterium tuberculosis，他们评估以 ID91 作为抗原的蛋白亚单位疫苗（TLR4 激动剂作为佐剂）和自复制 RNA 疫苗（采用纳米结构脂质载体 NLC 包封）在小鼠模型中的免疫原性和针对毒株 H37Rv 的免疫保护效果。蛋白亚单位疫苗和自复制 RNA 疫苗偏向于触发靶向不同 ID91 表位的细胞免疫。当仅仅注射一针疫苗时，两种类型的疫苗均能够降低小鼠肺部的细菌载量。当采用 RNA 疫苗初始免疫+蛋白疫苗加强免疫或者同时注射两种类型的疫苗（联合免疫）进行加强免疫均能够最大限度降低细菌载量，同时触发独特的体液和细胞免疫反应。这是首次报道自复制 RNA 疫苗能够作为结核菌疫苗研发的有效平台，而且，也充分说明发掘同时含有 CD4+和 CD8+T 细胞表位的结核菌抗原的重要性。

　　ID91 是由 4 种结核菌蛋白组成的融合蛋白，分别包括：Rv3691 基因编码的 esxV 蛋白,Rv3478 基因编码的 RpfD 蛋白,Rv1886 基因编码的 PPE60 蛋白以及 Rv2389 编码的 Ag85B 蛋白。这些蛋白之所以能够选为候选结核疫苗的抗原是因为它们在类不存在同源序列，同时，能够触发源自结核菌素阳性的外周血单核细胞（PBMC）分泌 IFN-γ，也就是证明这些抗原在内具有免疫原性。将编码 ID91 抗原的基因插入到自复制 RNA 骨架中，构建 repRNA D91，并且，证实其能够在 BHK 细胞中正常表达 ID91 蛋白。

　　用 repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗或者 GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗（TLR4 作为佐剂）间隔 3 周，二次免疫小鼠。加强免疫 2 周后，用 ID91 蛋白或者 13 个不同的肽库刺激来自免疫小鼠的脾脏。研究人员发现，GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗能够触发 CD4+（红色）和 CD8+ T 细胞反应（蓝色），而且，大部分是 CD4+ Th1 反应，相比之下，repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗大部分驱动的是 CD8+ T 细胞反应和促炎症因子反应。

　　研究人员首先评估 repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗或者 GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗一针免疫小鼠 6 个月后的免疫原性和预防感染的效果。一针 GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗能够触发强烈的 CD4+CD44+TH1 T 细胞反应（分泌 FINγ，IL-2 以及 TNF）。相反，一针 repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗更加倾向于触发 CD8+CD44+T 细胞反应（分泌 FINγ，IL-2 以及 TNF），同时也能产生中等水平的 TH1 CD4+ T 细胞反应。两种类型的疫苗均能触发靶向 ID91 和 Rv1886 的强烈的 IgG 体液免疫。同时，相比于生理盐水对照组，在低剂量的结核菌攻毒试验中，两种疫苗均能显著降低肺部结核菌载量：一针 GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗降低 0.55 log，而一针 repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗降低 0.403 log。以上数据说明，repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗在小鼠体内是具有免疫原性的，能够提供一定程度的预防保护效果。

　　接着，研究人员采用同源加强免疫、异源加强免疫以及联合免疫评估蛋白亚单位疫苗和 RNA 疫苗在超低剂量结核菌攻毒试验中的免疫原性和预防保护效果。GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗二次加强免疫后要比只接种一针具有更好的免疫保护效果，也就是说肺部结核菌载量相比生理盐水对照组会降低更多(0.743 log)。然而，repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗二次加强免疫后，小鼠肺部结核菌载量只出现适度降低（0.306 log），并没有比一针免疫的效果更好。对于异源免疫来说，RNA 初始免疫+蛋白加强免疫降低结核菌肺部载量 0.847 log，免疫预防效果是最好的。蛋白/RNA 同时联合免疫能够将肺部结核菌载量降低 0.809 log，而且脾脏中结核菌载量也是最低的（相比生理盐水组，结核菌载量降低 1.419 log）。

　　肌肉注射路线基本上无法触发强烈的黏膜免疫。相比生理盐水对照组，研究人员发现只有 GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗加强免疫的小鼠肺泡灌洗液中才能检测到统计学上较为明显的 IgA 抗体滴度，其他组加强免疫的小鼠肺泡灌洗液中只能检测到极低的 IgA 抗体滴度。GLA-SE ID91 蛋白亚单位结核菌疫苗同源加强免疫和联合加强免疫触发的 ID91 特异性的血清 IgG 抗体滴度是最高的，而 repRNA D91 自复制 RNA 结核菌疫苗加强免疫后触发的 ID91 特异性的血清 IgG 抗体滴度是最低的。加强免疫后触发的 ID91 特异性的血清 IgG1/2c 抗体滴度也是类似的情况。

　　对于所有的加强免疫组小鼠来说，CD4+或者 CD8+细胞分泌的 IL-2/GM-CSF/IL-17A 没有任何显著的区别。然而，RNA 初始免疫+蛋白加强免疫组和联合免疫组 CD4+T 细胞分泌的 TNF 表达量更高，而且，联合免疫组 CD8+T 细胞分泌的 TNF 表达量更高。采用 ID91 蛋白或者多肽库刺激 CD8+T 细胞主要诱导 IL-2 或者 TNF 反应，而刺激 CD4+T 细胞主要诱导分泌 IFNγ+IL-2+TNF 或者 IFNγ+TNF 或者 TNF 反应。采用多肽库进行刺激 RNA 疫苗同源加强和联合加强免疫的 CD8+T 细胞时能够产生最多样化的免疫反应，但是，采用全蛋白刺激时，大部分 CD8+T 细胞的反应类型将会丧失。

　　这是首次报道自复制 RNA 结核菌疫苗在结核菌攻毒小鼠模型中展现出一定的免疫原性和预防保护效果。在超低剂量结核菌攻毒试验中，自复制 RNA 结核菌疫苗加强免疫的效果明显不如蛋白亚单位疫苗的免疫效果。ID91 抗原表位含有极少的 CD+8 T 细胞表位，对于自复 RNA 疫苗平台来说，并不是一个非常好的候选疫苗抗原。未来应选择含有 CD8+ T 细胞表位的抗原，以此来评估 CD8+T 细胞反应在抵御结核菌感染时所起到的作用。蛋白亚单位疫苗和自复制 RNA 疫苗触发的针对不同抗原表位的 CD4+和 CD8+ T 细胞反应是差异化的，所以采用异源免疫具有互补优势。尝试采用更加高效的递送系统（本文采用 NLC 递送载体）或者触发强烈的黏膜免疫，能够进一步增强结核菌 RNA 疫苗的免疫效果。相比于预防性的病毒 mRNA 疫苗来说，细菌性 mRNA 疫苗的研发无疑更加充满挑战性。

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